Naukowcy z Francji opracowali system pozwalający obserwować proces koniugacji bakterii w czasie rzeczywistym, dzięki któremu wykazali, że pilus F może być kanałem, przez który zachodzi transfer ssDNA, bez konieczności bezpośredniego połączenia komórek - dotychczas zagadnienie to pozostawało w sferze spekulacji. Wyniki badań opublikowano w “Science“.

Naukowcy stworzyli fuzję translacyjną białek SeqA oraz YFP (ang. yellow fluorescent protein, białko żółtej fluorescencji), umożliwiając podglądanie koniugacji na poziomie pojedynczych komórek, co pozwala nie tylko na dokładniejsze przyjrzenie się temu procesowi, ale także na śledzenie losów DNA i bardziej precyzyjne obliczenie częstości zachodzących procesów genetycznych, na przykład rekombinacji homologicznej prowadzącej do włączenia nabytych genów do chromosomu, czy też szybkości degradacji DNA, gdy rekombinacja nie jest możliwa.

Białko SeqA jest negatywnym regulatorem inicjaji replikacji u E. coli i wykazuje wysokie powinowactwo do DNA hemimetylowanego przez metylazę Dam. W eksperymentach dawcami były szczepy Hfr przeprowadzające metylację, natomiast biorcami były komórki pozbawione metylazy, wytwarzające białko fuzyjne SeqA-YFP. Łączyło się ono trwale i specyficznie z DNA nabytym przez komórkę podczas koniugacji (kiedy to przekazywana jest tylko jedna nić DNA, druga dosyntezowywana jest już w komórce biorcy).

Koniugacja plazmidu F to proces, w którym plazmid ten przekazywany jest z komórki dawcy (F+, męska) do komórki biorcy (F-, żeńska), do czego niezbędne jest wytworzenie odpowiedniej, rurkowatej struktury - długiego i giętkiego wyrostka - pilusa płciowego. Udział pilusa w koniugacji był niewątpliwy, ale dotychczas brakowało przekonujących dowodów na to, czy DNA może być przez niego przekazywany, czy może transfer następuje dopiero po bezpośrednim połączeniu ścian komórkowych koniugujących bakterii.

Po przekazaniu nici DNA w komórce biorcy dosyntezowywana jest druga nić, a plazmid cyrkularyzuje. Ze względu na obecność wielu sekwencji homologicznych na plazmidzie i chromosomie, często dochodzi do rekombinacji homologicznej pomiędzy tymi cząsteczkami, prowadzącej do integracji plazmidu do chromosomu - powstaje wtedy szczep Hfr (ang. High frequency of recombination, o wysokiej częstości rekombinacji), który będzie koniugował tak samo jak szczep F+, ale przekazywany będzie również DNA chromosomowy, który w komórce biorcy musi ulec rekombinacji do chromosomu albo ulegnie degradacji. Plazmid F w szczepie Hfr może też wyrekombinować z powrotem tworząc autonomiczną cząsteczkę, a jeśli podczas tego procesu zabierze kawałek chromosomu, to mamy do czynienia z plazmidem F’.

Nowa metoda bezpośredniej obserwcji koniugacji pozwala

• obserwować transfer dowolnych cząsteczek DNA pomiędzy pojedynczymi komórkami,
• obserwować ekspresję genów wprowadzonych do komórki - w tym wypadku wprowadzano gen rfp (ang. red fluorescent protein, bialko czerwonej fluorescencji) pod odpowiednim promotorem,
• pokazać, że DNA może być przekazywany przez pilus bez kontaktu komórek,
• przy zastosowaniu szczepów niezdolnych do rekombinacji (recA^-) pokazać szybkość degradacji nabytego DNA przez kompleks RecBCD,
• pozwala analizować losy nabytego DNA - tylko w 3,3 procent przypadków DNA uległ degradacji, w pozostałych rekombinowało do chromosomu,

Szczególnie interesujące może okazać się wykorzystanie tego systemu do śledzenia losów DNA przekazywanego międzygatunkowo.

Marta Warsińska

———————————
Oryginalna publikacja: Ana Babić et al., “Direct Visualization of Horizontal Gene Transfer”, Science 319, 1533 (2008), doi:10.1126/science.1153498

Zobacz również:
- Dodatkowe materialy wideo koniugujących bakterii na stronie Sciencemag.org